Dec 17 2020

Large Population Sample of Rio de Janeiro Study Aiming at the Implementation of NGS Technology in Criminal DNA Laboratories

Within the field of human identification by Forensic Genetics, the most used methodology today involves the study of microsatellite regions – short tandem repeats, or STRs – after amplification of genetic material in a PCR reaction and analysis of DNA fragments through capillary electrophoresis.

However, this technique usually involves the discrimination of alleles identified only by their size, ignoring any polymorphisms present in the sequences of these alleles. In this context, the application of massively parallel sequencing (MPS) platforms has been proposed by several research groups around the world, especially in the last decade.

The massively parallel sequencing (MPS) platforms, a term coined in 2000 by the Sydney Brenner group, allow simultaneous analysis of thousands to millions of DNA fragments, generating large amounts of data in a run and from very small amounts of material compared to traditional methods. MPS techniques are already used on a large scale in laboratories around the world, especially in studies and examinations focused on Clinical Genetics and Oncogenetics.

However, its application in the field of Forensic Genetics can still be considered limited to the academic environment and with little application in daily practice, although it is a technique that can bring great advances to forensic analyses. The main asset of this technology in the analysis of STR-type genetic markers is that it is possible to discriminate not only the size of alleles (based on the number of repetitive sequences that compose them) but also their nucleotide sequence.

This type of information can be very useful to differentiating alleles from different contributors. Several studies have shown a huge gain in the power of discrimination with the sequencing of STR regions on MPS platforms, translated into detection of a greater number of alleles, higher sensitivity and greater deconvulation capacity of genetic profiles presenting mixtures of more than one individual, such as those often found in evidence collected at crime scenes or associated with crimes of sexual violence.

However, in this potential to translate into effective results for investigations and justice, it is necessary that new allelic frequencies be characterized in several populations considering polymorphisms not detected by the conventional capillary electrophoresis technique.

Thus, following the requirements of the International Society of Forensic Genetics and aiming at the future implementation of MPS technology in the IPPGF/SEPOL laboratory, this study aims to verify the agreement between two methodologies of genotyping of autosomal STRs (capillary electrophoresis and MPS on the Ion Torrent PGM platform®) in a large population sample of the State of Rio de Janeiro, detecting new polymorphisms and establishing new allelic frequencies, as well as confirming the genotyping by the gold standard already established in criminal databases.

The project is funded by FAPERJ (Notice 07/2018 – Program to Support Innovation Projects in the Field of Forensic Science 2018) and has been developed in a partnership between IPPGF/SEPOL and the Firmino Torres de Castro Macromolecular Metabolism Laboratory of the Carlos Chagas Filho Biophysics Institute, Federal University of Rio de Janeiro.

During her presentation in the GCLAITH meeting at ISHI 31, Carolina Bottino presented preliminary results obtained from the study, which demonstrated the increase in the discrimination power of the MPS technique in the analysis of autosomal STR regions, especially reflected in the greater number of different alleles detected and changes in forensic parameters such as heterozygosity, matching probability  and exclusion power.

As there was not enough time during her presentation to answer all questions that came in, we’ve compiled them here.

Considering isoalleles in NGS, how do you determine allele frequencies in comparison with alleles determined with CE? 

The frequencies of the isoalleles are calculated by simple counting, in the same way as in capillary electrophoresis. The difference is that in addition to considering the size of the alleles, sequences are also considered.

Carolina, in your study is it possible to know if the isoalleles respect the Mendelian inheritance or if they are new mutations, and therefore they would not be used to analyze the genetic link? 

In my study, we analyzed only unrelated individuals, so we had no way of verifying how these isoalleles inherit. But other studies indicate that they are inheritable sequences and not de novo mutations, so they could be used in genetic linkage analyzes.

Dentro do campo da identificação humana por Genética Forense, a metodologia mais empregada hoje envolve o estudo de regiões microssatélites – short tandem repeats, ou STRs – após a amplificação do material genético numa reação de PCR e análise dos fragmentos de DNA através de eletroforese capilar. No entanto, esta técnica normalmente envolve a discriminação dos alelos identificados apenas pelo seu tamanho, ignorando eventuais polimorfismos presentes nas sequências desses alelos. Nesse contexto, a aplicação de plataformas de sequenciamento massivo paralelo (SMP) tem sido proposta por diversos grupos de pesquisa do mundo, especialmente na última década. As plataformas de sequenciamento massivo paralelo (SMP), termo cunhado em 2000 pelo grupo de Sydney Brenner, permitem a análise simultânea de milhares a milhões de fragmentos de DNA, gerando grandes quantidades de dados em uma corrida e a partir de quantidades muito pequenas de material comparadas aos métodos tradicionais. Técnicas de SMP já são utilizadas em larga escala em laboratórios do mundo todo, especialmente em estudos e exames voltados para Genética Clínica e Oncogenética. Entretanto, sua aplicação no campo da Genética Forense ainda pode ser considerada limitada ao meio acadêmico e com pouca aplicação na prática cotidiana, embora seja uma técnica que pode trazer grandes avanços às análises periciais. O principal trunfo desta tecnologia na análise de marcadores genéticos do tipo STR é que é possível discriminar não apenas o tamanho dos alelos (baseado no número das sequências repetitivas que os compõem) mas também a sua sequência de nucleotídeos. Este tipo de informação pode ser muito útil para diferenciar alelos de diferentes contribuintes. Diversos estudos tem demonstrado um enorme ganho no poder de discriminação com o sequenciamento de regiões STR em plataformas de SMP, traduzido em detecção de um maior número de alelos, maior sensibilidade e maior capacidade de deconvulação de perfis genéticos apresentando mistura de mais de um indivíduo, tais como aqueles frequentemente encontrados em evidências coletadas em locais de crime ou associadas a crimes de violência sexual. Entretanto, para que tal potencial se traduza em resultados efetivos para as investigações e para a Justiça, é necessário que sejam caracterizadas, em diversas populações, novas frequências alélicas levando-se em consideração os polimorfismos não detectados pela técnica convencional de eletroforese capilar. Desta forma, seguindo as exigências da Sociedade Internacional de Genética Forense e visando a futura implantação da tecnologia MPS no laboratório do IPPGF/SEPOL, este estudo tem por objetivo verificar a concordância entre duas metodologias de genotipagem de STRs autossômicos (eletroforese capilar e SMP na plataforma Ion Torrent PGM®) em uma grande amostra populacional do Estado do Rio de Janeiro, detectando novos polimorfismos e estabelecendo novas frequências alélicas, bem como confirmar a genotipagem pelo padrão ouro já estabelecido nos bancos de dados criminais. O projeto conta com o financiamento da FAPERJ (Edital 07/2018 – Programa de Apoio a Projetos de Inovação no Campo da Ciência Forense 2018) e vem sendo desenvolvido numa parceria entre o IPPGF/SEPOL e o Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Serão apresentados os resultados preliminares obtidos até o momento, que já demonstram o aumento do poder de discriminação da técnica de SMP na análise de regiões STR autossômicas, especialmente refletidos no maior número de diferentes alelos detectados e mudanças em parâmetros forenses como heterozigosidade, matching probability e poder de exclusão.

Considerando isoalelos en NGS, cómo se determinan las frecuencias alélicas, en comparación con los alelos determinados con CE? 

As frequências dos isoalelos são calculadas por contagem simples, da mesma forma que é feita na eletroforese capilar. A diferença é que além de considerar o tamanho dos alelos também são consideradas as sequências.

Carolina, no seu estudo é possível saber se os isoalelos respeitam a herança mendeliana ou se são mutações de novo, e portanto não serviriam para análise de vínculo genético?

No meu estudo nós analisamos apenas indivíduos não relacionados, então não tivemos como verificar como se dá a herança desses isoalelos. Mas outros estudos indicam que são sim sequências herdáveis e não mutações de novo, portanto poderiam ser utilizados em análises de vínculo genético.

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